1  γ-氨基丁酸的测定

1.1　仪器

1.1.1  高效液相色谱仪：附紫外检测器

1.1.2  分析天平：感量0.01mg

1.1.3  AccQ-Tag衍生管

1.1.4  涡旋搅拌器

1.1.5  100μL、1000μL微量移液枪

1.1.6  烘箱：可恒温至55℃

1.1.7  封口膜

1.1.8  0.22μm滤膜

1.2  试剂

1.2.1  氨基酸荧光衍生试剂2A：预热烘箱到55℃，轻弹2A瓶以确保所有的试剂粉末都在瓶底，用干净的吸液管枪头从2B瓶种吸取1mL的AccQ-Fluor稀释液，将稀释液加到2A瓶中，漩涡混合15sec，在烘箱内加热以溶解所有的试剂粉末（加热时间不要超过10min）。

1.2.2  氨基酸荧光衍生试剂2B

1.2.3  950mL氨基酸洗脱液A（Eluent A）

1.2.4  950mL氨基酸洗脱液B（Eluent B）

1.2.5  乙腈：HPLC级

1.2.6  γ-氨基丁酸标准品：Wako或等同标准品

1.2.7  萃取液：纯水

1.3　色谱条件

1.3.1　色谱柱：AccQ-Tag Ultra AAA column，BEH 2.1×100mm P/N 186003837或同类型色谱柱。

1.3.2  流动相： 流动相A1为50mL EluentA浓液加950mL水，流动相B2为Eluent B。弱洗针液为乙腈-水（5:95），强洗针液为乙腈-水（95:5）。

按下表进行梯度洗脱

1.3.3  柱温：55℃

1.3.4  检测波长：260nm

1.3.5  运行时间：10min

1.3.6  流速：0.5mL/min

1.3.7  进样量：2.0μL

1.4  标准贮备溶液的制备：准确称取约40mgγ-氨基丁酸标准品于10mL容量瓶中，加入纯水溶解并定容，摇匀。

1.5　标准工作溶液的制备：准确量取1.0mLγ-氨基丁酸标准储备液于10mL容量瓶中，加入纯水溶解并定容，摇匀。

1.6　样品溶液的制备：取20粒样品，研磨粉碎，称取0.1g样品于50mL离心管中，取样品25mL，用高纯水溶解，旋涡振荡混合10sec，超声波溶解20min，以3000r/min离心3min，用0.22μm滤膜过滤上层清液至液相色谱仪样品瓶中。将烘箱开启并恒温至55℃，用清洁的移液器移取10μL，过滤，将样品注入清洁的衍生试管底部，换一清洁的微量移液管头，加70μL AccQ Fluor Buffer1至衍生管中，涡旋混合，另换一清洁的微量移液管头吸取20μL AccQ Fluor衍生剂（2A），于涡旋状态下加到衍生管中，并保持涡旋混合15sec，在室温下放置1min，将衍生管用石蜡膜封口，放在55℃烘箱内加热10min，加热后取出，将衍生物转移到带塑料弹簧的300μL内插管中，再将此内插管放到HPLC样品瓶中，准备进样。

1.7　结果计算

std.Wt.×P×A

C₁ = ————————

D₁×D₂

式中：

C₁—标准工作溶液浓度，mg/mL；

std.Wt.—称取标准物质的重量，mg；

P—标准物质的纯度（100%纯标准品，P=1）；

A—移取标准储备溶液体积，mL；

D₁—标准储备液定容体积，mL；

D₂—标准工作液定容体积，mL；

Astd

R.F.= ————

Cstd

式中：

R.F.—校准相应因子

Astd——标准工作液于260nm波长处的吸收峰面积；

Cstd——标准工作液浓度，mg/mL。

Asmp

X = ————————

Smp.Wt.×R.F.

式中：

X—样品中γ-氨基丁酸含量，mg/g；

Asmp—样品溶液于260nm波长处的吸收峰面积；

Smp.Wt.—样品质量，g；

R.F.—校正因子。

2  酸枣仁皂苷A和B的测定

2.1　仪器

2.1.1　分析天平

2.1.2　液相色谱仪

2.1.3　ELSD检测器

2.1.4　超声波振荡器

2.2　试剂

2.2.1　甲醇：HPLC级

2.2.2　冰乙酸：HPLC级

2.2.3　酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B：纯度以100%计，购自中国食品药品检定研究院或等同标准品。

2.2.4　萃取液：量取600mL甲醇与400mL纯水，混合均匀。

2.3　色谱条件

2.3.1　色谱柱：C18，4.6mm×150mm×5μm或同类型色谱柱。

2.3.2  流动相：流动相A为甲醇，流动相B为1%乙酸（量取10mL冰乙酸至1L广口试剂瓶中，加入纯水1000mL，混合均匀后过滤，脱气待用）。

2.3.3  柱温：30℃

2.3.4  流速：1.0mL/min

2.3.5  进样体积：10.0μL

2.3.6  运行时间：20min

2.3.7  ELSD 温度：50℃；ELSD压力：3.0～3.5bar；ELSD Gain：7；ELSD Filter：5。

按下表进行梯度洗脱

2.4　标准贮备溶液的制备：分别准确称取约10mg酸枣仁皂苷A和B标准品于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，摇匀。

2.5  标准工作溶液的制备：准确量取0.1、0.3、0.5、0.8、1.0mL酸枣仁皂苷A和B标准贮备溶液于10mL容量瓶中，加入甲醇溶解并定容，摇匀。

2.6　样品溶液的制备：取20粒样品，研磨粉碎，称取样品约8.0g于50mL离心管内，加入25mL萃取液，旋涡振荡混合10sec，放入超声波振动器中超声提取20min，以3000r/min离心3min，用0.45μm有机系针头过滤器过滤上层清液至液相色谱仪样品瓶中待进样。

2.7　标准溶液浓度的计算

std.Wt.×P×A

C₁ = ————————

D₁×D₂

式中：

C₁—标准工作溶液浓度，mg/mL；

std.Wt.—标准品质量，mg；

P—标准物质的纯度，100%纯标准品，P=1；

A—移取标准储备溶液体积，mL；

D₁—标准储备溶液定容体积，mL；

D₂—标准工作溶液定容体积，mL。

2.8　标准曲线的绘制：以标准工作溶液峰面积的常用对数值y对标准工作液浓度（mg/mL）的常用对数值x作标准曲线，求得标准曲线方程y=ax+b。

2.9　结果计算

C×V

X₁ = —————

Smp.Wt.

式中：

X₁—样品中酸枣仁皂苷A的含量，mg/g；

C—由标准曲线方程求得的样品中酸枣仁皂苷A的浓度，mg/mL；

V—样品溶液总定容体积，mL；

Smp.Wt.—样品质量，g。

C×V

X₂ = —————

Smp.Wt.

式中：

X₂—样品中酸枣仁皂苷B的含量，mg/g；

C—由标准曲线方程求得的样品中酸枣仁皂苷B的浓度，mg/mL；

V—样品溶液总定容体积，mL；

Smp.Wt.—样品质量，g。

酸枣仁皂苷A和B含量（mg/g）=酸枣仁皂苷A含量（mg/g）+酸枣仁皂苷B含量（mg/g）